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인산단백질 분석서비스
분석 대상 : 세포 · 조직 추출물의 인산단백질
분석 내용:
1. 세포 · 조직 추출물에서 인산단백질의 분리 및 농축
2. 2 차원 전기 영동의 실시
3. 인산단백질 염색 (ProQ Diamond (Invitrogen) 사용)
4. MALDI-TOF에 의한 인산단백질의 식별 및 인산화 사이트 결정
(인산단백질 SDS-PAGE 염색)
Cat. No. P8010 가격 260,000원/sample

(인산단백질 2-DE Gel 염색)
Cat. No. P8011 가격 280,000원/sample

(인산단백질 PMF 동정)
Cat. No. P8020 가격 60,000원/sample (*비동정시 40,000원)

(인산펩타이드 MALDI-TOF PSD 동정)
Cat. No. P8030 가격 100,000원/sample

(CAF sequencing 인산화 부위 결정)
Cat. No. P8040 가격 180,000원/sample
* 장비 점검으로 인해 잠정 중단되었습니다.

(인산단백질 발현)
Cat. No. P8050 가격 320,000원/sample

Cat. No. P8060 가격 280,000원/sample


[서비스 아이템 1-1] Phosphoprotein staining service(SDS-PAGE)
Cat. No. P8010 가격 260,000원/sample
Step1 : 전기영동
기본적으로 10-15 % 젤을 사용하여 분석을 수행합니다. 특정 조건을 지정하실 경우 주문시 미리 말씀해 주시기 바랍니다.

Step2 : 염색
방법1: ProQ 다이아몬드 염색(Molecular Probes)
검출 방법: ProQ 형광염색(Ex/Em: 555/580nm)
사용 필터: Ex/Em: Cy3/Cy3
방법2: 콜로이드 CBB 염색

Step3 : 다중염색(CBB & ProQ염색)과 spot 비교

Step4 : 차동 디스플레이와 비교분석 실시


Staining with CBB or ProQ


[서비스 아이템 1-2] Phosphoprotein staining service(2-DE Gel)
Cat. No. P8011 가격 280,000원/sample

Step1 : 전기영동
기본적으로 아래의 젤을 사용하여 분석을 수행합니다.특정 조건을 지정하실 경우 주문시 미리 말씀해 주시기 바랍니다.
1차원 등전점 전기영동:pH4-10(non linear IPG) 2차원 SDS-PAGE(10-15%)

Step2 : 염색
방법1: ProQ 다이아몬드 염색(Molecular Probes)
검출 방법: ProQ 형광 염색(Ex/Em: 555/580nm)
사용 필터: Ex/Em: Cy3/Cy3
방법2: 콜로이드 CBB 염색

Step3 : 다중염색(CBB & ProQ염색)과 spot 비교

Step4 : 차동 디스플레이와 비교분석 실시


[서비스 아이템 2] Phosphopeptide identification by PSD
Cat. No. P8020 가격 60,000원/sample (*비동정시 40,000원)
Step1 : PMF(Peptide Mass Fingerprinting)에 의한 단백질 동정

Step2 : 인산화 펩타이드로 예측되는 질량 값을 비교하여 인산화 가능성 예측






[서비스 아이템 3] Phosphopeptide identification by PSD
Cat. No. P8030 가격 100,000원/sample

Step1(옵션) : PMF에 의한 인산펩타이드 예측
Step2(옵션) : PhosPepTM에 의한 ProQ 염색 밴드(스팟)의 소화와 인산펩타이드 발현
Step3 : MALDI-TOF PSD로 인산펩타이드 동정






[서비스 아이템 4] phosphorylation site determination by CAF sequencing
Cat. No. P8040 가격 180,000원/sample
* 장비 점검으로 인해 잠정 중단되었습니다.

※ 본 서비스 아이템 이용을 위해 P8030으로 인산펩타이드를 먼저 확인하는 과정이 필요할 수 있습니다.
Step1 : ProQ 염색된 스팟을 트립신으로 절단 후 SPITC 표시
Step2 : PhosPepTM에 의해 인산펩타이드 발현
Step3 : MALDI-TOF PSD로 CAF sequencing 후, 인산화 부위 결정






[서비스 아이템 5] Phosphoprotein enrichment plus Service item1
Cat. No. P8050 가격 320,000원/sample

※ 본 서비스는 제노마인의 독자 기술을 이용하여 인산화 단백질 특이 적으로 농축 세포 내에 소량 밖에없는 인산화 단백질을 회수 할 가능성을 높입니다.

Step1 : PhosProTM kit 을 사용하여 세포 전체 또는 쌍 직분 화면 단백질에서 인산화 단백질을 발현
Step2 : 인산단백질 염색 (Cat.No. P8010 또는 P8011과 동일)
 
인산단백질 발현을 통한 확인

 
- 이 기술은 GENOMINE 독자 기술이 사용된 것으로, 인산단백질을 특이적으로 발현시켜 세포 내에 소량 존재하는 인산단백질 회수 가능성을 향상시켰습니다.
- 세포 전체 또는 조직 분획 단백질에서 인산단백질 농축이 가능합니다.
- 인산단백질만을 분획하는 특이성, 민감도, 발현률이 매우 높습니다.
 
 
인산단백질 발현 기술과 성능
 
SKOV ovarian cancer cell을 2-DE Lysis buffer 분쇄 한 후, 10mg의 total protein을 이용하여 GENOMINE 독자적인 실험 방법에 의해 인산단백질을 농축하였습니다.
2-DE gel은 4-10NL 24cm IPG strip에 focucing하고 24X20cm의 12 % 2nd gel에 전기영동을 실시하였습니다.
그 결과 10mg의 전체 단백질에서 분획한 SKOV ovarian cancer cell의 인산화 단백질 SPOT은 CBB staining 약 1200 개가 확인(그림 A) ProQ Diamond를 이용한 인산화 단백질 특이 적 염색은 약 700 개 나머지 SPOT 확인할 수 있었습니다.(사진 B)
조직과 세포의 전체 단백질에서 GENOMINE의 인산단백질 분획 방법에 의해 다수의 인산단백질을 발현하여 관찰할 수 있었습니다.

 
[서비스 아이템 6] Phosphoprotein identification by LC-MS/MS
Cat. No. P8060 가격 280,000원/sample
 
LC-MS/MS를 이용한 인산화 부위 확인
 
LC-ESI-MS/MS 분석은 단백질을 Trypsin 에 의해 가수분해한 후 reverse phase liquid chromatography(역상 액체 크로마토 그래피)를 이용하여 tryptic peptide의 hydrophobicity에 의해 분리, 질량분석기에 넣는다.
ESI(Electrospray ionization) 방식에 의해 이온화 된 펩타이드는 전기장 안에서 이동시켜 질량을 측정하며, 이 때 공기 분자와 충돌시켜 peptide 를 산산조각 한다. 또한 아미노산 단위로 잘린 peak를 얻을 수 있고, 이 스펙트럼 을 기반으로 데이터베이스 에 존재하는 단백질 서열과 비교 분석한다.
Phosphorylation을 분석하기 위해서는 데이터베이스에 존재하는 단백질 배열로 나올 가능성이 있는 phosphorylation과 실제의 스펙트럼을 비교한다.
이때 비교하는 것은 S/T 또는 Y로 phosphorylation에 의해 나타나는 mass shift(80 Da)와 해당 peptide를 fragmentation시킬 때 나타나는 아미노산 서열 mass shift 또는 neutral loss(97.9Da)를 비교한다.
일반적으로 S, T, Y 인산화 되면 PO3의 형태로 약 80Da의 MASS 값이 증가되지만, MS 기기 fragmentation하는 경우 H2PO4(약 98Da)의 MASS 값이 감소되기 때문이다.

 
 
 
식물 인산단백질 분획
 
배추잎 인산단백질 분획물 (PhosPro 사용) 중 1mg사용 이차원전기영동
 
 
- 배추 10g의 조직으로 단백질 추출 약 2mg의 인산단백질 분획
- 인산단백질 분획 대부분이 인산단백질 특이점 염색에서 분획 되는 것을 확인: CBB염색으로 약 562개의  spot을 확인하고 그 중 ProQ diamond 염색으로 약 400개의 인산단백질 spot 확인
 
 
 
-야생잔디 (Brachypodium) 10g에서 전체 단백질 추출
: 4mg의 인산단백질 분획물 중 1mg사용

 

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